分析引物
下面，我们将分析现有引物组的物理化学性质。由于我们之前设计的一套引物比较少，所以我们会先加载一套新的引物。
加载引物
与模板类似，引物也可以从FASTA文件加载。类似于确保头中的信息通过正确加载read_templates ()，您应该确保FASTA文件中正确地注释了引物方向。这意味着每个引物的标题都应该包含一个关键字，可以唯一地标识该引物是正向引物还是反向引物。我们要加载的FASTA文件包含为人类IGH基因可变区域设计的正向引物Ippolito等人。．由于所有引物都是正向引物，FASTA文件中所有引物的头都用' _fw '关键字标注。因此，我们设置fw.id理由read_primers ()因此:
定义要加载的FASTA引物文件底漆。位置< -执行（“extdata”，“IMGT_data”，“引物”，“IGHV”，“Ippolito2012.fasta”，包=“openPrimeR”）#加载底漆底漆。df < -read_primers(primer.locationfw.id＝“_fw”）我们可以通过以下方式查看引物的标识符和序列:
打印(primer.df [,c（“ID”，“转发”)))#> ID Forward#> 2 Ippolito2012|VH1|1_fw caggtccagctkgtrcagtctgg#> 1 Ippolito2012|VH157|2_fw caggtgcagctggtgsartctgg#> 3 Ippolito2012|VH2|3_fw cagrtcaccttgaaggagtctg#> Ippolito2012|VH3|4_fw gaggtgcagctgktggagwcy#> 7 Ippolito2012|VH4|5_fw caggtgcagctgcaggagtcsg#> 6 Ippolito2012|VH4-DP63|6_fw caggtgcagctacagcagtggg#> 8 Ippolito2012|VH6|7_fw caggtacagctgcagcagcagtca#> Ippolito2012|VH3N|8_fw tcaacacaacggttcccagtta生化约束条件评价
为了确定加载的引物满足哪些生化约束，我们可以使用check_constraints ()，它只需要一组底漆、一组模板和一个设置对象。由于我们想要确定沿着整个模板序列的引物的覆盖率，我们将通过修改约束设置将允许的偏离覆盖率事件的比例设置为100%。然后我们调用check_constraints ()以确定定义的所有约束条件设置：
#允许脱靶覆盖conOptions(设置)＄allowed_other_binding_ratio < -c（“马克斯”＝1．0）#评估在“设置”中发现的所有约束constraint.df<-check_constraints(底漆。df、template.df设置,active.constraints＝的名字（约束(设置)))注意，我们也可以只计算via指定的约束的子集设置如果我们通过了active.constraints参数check_constraints ()．的constraint.df变量提供引物包含计算通过提供的所有约束的结果的数据帧设置(例如底漆覆盖率，气相色谱比，熔化温度)。中的相应列可以检索各个约束的值constraint.df．在下文中，我们将更详细地探讨模板的覆盖范围。
底漆覆盖
类中标注了每个入门程序所覆盖的模板的数量primer_coverage专栏:
为了识别覆盖单个模板的引物，我们可以使用注释模板数据帧中的覆盖信息update_template_cvg ()：
现在,primer_coverage列也可以在template.df这样我们就可以确定覆盖集合中前五个模板的引物的数量:
覆盖模板序列的总体比例可以通过get_cvg_ratio ()：
输出结果表明，根据当前指定的引物覆盖条件，引物集有望扩增99.35%的模板(最多3个错配)。我们可以通过计算进一步的统计数据来了解更多的覆盖率。例如，我们可能感兴趣的是确定哪些模板组需要被放大，哪些不需要。为此，我们可以使用get_cvg_stats ()，它根据模板序列的组注释提供了覆盖模板序列数量的信息:
| 集团 | 报道 |
|---|---|
| 总计 | 155人中的154人(99.35%) |
| IGHV1 | 25 / 25 (100%) |
| IGHV2 | 21 / 21 (100%) |
| IGHV3 | 55 / 56 (98.21%) |
| IGHV4 | 47 / 47 (100%) |
| IGHV5 | 3 / 3 (100%) |
| IGHV6 | 2 / 2 (100%) |
| IGHV7 | 1 / 1 (100%) |
在这种情况下，我们看到除了一个IGHV3模板外，所有的模板似乎都没有被引物集覆盖。覆盖范围的可视化可以通过
这张图显示了三个条形图:
- 身份的报道:被与模板完全互补的引物覆盖的模板的比例
- 预期的报道:在当前条件下计算覆盖模板的期望覆盖率
- 可用的模板:每组模板中可用的模板序列的数量
对于加载的引物集，识别覆盖率几乎与预期覆盖率一样高，这表明所分析的引物集应该具有较高的扩增保真度。请注意，对于IGHV5，识别覆盖率为0%，而预期覆盖率为100%。这只是表明没有引物能够完全补充任何IGHV5模板，然而，根据覆盖条件，有引物可以通过不匹配的绑定覆盖所有IGHV5模板。
最优引物子集
通常，出于成本和引物效率的考虑，人们希望避免使用大型引物集。我们提供了一种方法，通过计算关于模板覆盖的最优子集来减少现有引物集的大小。使用这种方法，可以在不牺牲任何覆盖的情况下限制引物集的大小。我们可以计算覆盖已经被注释的引物集的所有最优子集subset_primer_set ()：
primer.subsets是一个列表我-th条目包含大小的引物集我．例如，大小为3的最优子集可以通过primer.subsets [[3]]．通过绘制所有最优子集的覆盖率，我们可以很容易地确定最合适的子集:
该图表显示了两种类型的信息。折线图表示被覆盖模板的总百分比，堆叠柱状图表示单个引物的覆盖率。由于集合中的一些引物覆盖相同的模板，对于大小为3或更大的子集，堆叠条的累积覆盖率超过100%，尽管对于大小为3的子集，总覆盖率似乎已经饱和。有3个以上引物的子集似乎只能提供额外的模板冗余覆盖。因此，我们可能决定选择大小为3的引物子集，因为它似乎可以实现与完整引物集相同的覆盖:
我们可以验证整个引物集的覆盖范围和大小为3的子集似乎是匹配的get_cvg_ratio ()：
结合区域
引物在模板中的结合区域可以用plot_primer_binding_regions ()：
该图的x轴显示引物相对于目标结合区域的结合位置。位置－1表示目标结合区域的结束，我们可以看到所有引物都在目标区域之外结合。由于我们指定了免疫球蛋白的前导子作为靶区，这就意味着所有引物都在外显子的开头结合，这就保证了引物可以恢复完整的抗体序列。用于扩增免疫球蛋白的典型引物集将针对外显子，即直接跟随前导子的区域。为了研究各个模板的引物绑定的各个位置，我们可以使用plot_primer ()．在这种情况下，我们只是为绘图函数提供了第一个引物和前十个模板，以限制绘图的维度:
该图将覆盖模板的引物以箭头形式显示在相应模板上方。如果模板被覆盖，则显示为黑线，否则显示为灰色。
约束评价
我们可以确定哪些引物通过了提供给check_constraints功能通过视觉检查通过plot_constraints ()：
该图显示了每个引物的哪些约束被传递(蓝色)，哪些约束失败(红色)。例如，查看指示GC钳约束的列，我们看到只有Ippolito2012|VH3|4_fw和Ippolito2012|VH6|7_fw和Ippolito2012|VH3N|8_fw不满足我们对GC钳的要求。这是因为两个引物都没有GC钳，尽管我们在设置中要求GC钳的长度在1到3之间:
#查看不符合GC约束的引物的终端GC数量constraint.df＄gc_clamp_fw [！constraint.df＄EVAL_gc_clamp]#> [1] 0 0 0#查看所需的终端gc数量:约束(设置)＄gc_clamp#> min最大值#> 1如果你想知道为什么所有评估引物的特异性似乎都很低，这可以用引物的结合区域来解释。正如我们前面所看到的，所有引物都在目标结合区外结合。因此，每个引物的特异性都是0%，永远无法满足引物特异性的约束。
我们不仅可以看到一个引物是否通过了一个特定的约束，还可以看到一个特定属性对应的值的分布。例如，让我们通过创建直方图来看看引物中末端gc的数量:
y轴表示引物在其3 '端显示一定数量的gc的数量。虚线表示根据我们传递到的设置对象所期望的GC钳的范围plot_constraint ()．
筛选引物
我们之前所有的评估都是在不要求引物实际满足我们假设的任何约束条件的情况下进行的。我们可以根据一组生化约束条件筛选引物，这样只保留满足所有要求的引物。例如，如果我们想只选择满足GC钳和熔化温度范围要求的引物，我们可以通过以下方式获得过滤后的数据集:
现在，我们可以对这个数据集进行进一步的分析。例如，使用get_cvg_ratio ()，我们可以确定过滤后的引物集覆盖模板的百分比仅为13.55%，因为过滤后只剩下1个引物。
报告生成
通过将已分析的引物集及其相应的模板和设置传递给，我们可以创建一个PDF报告，该报告总结了一组引物的分析create_report ()：
定义输出文件的路径我的。文件< -tempfile（fileext =. pdf”）#为约束存储PDF报告。my.file中的Df 'create_report(约束。df、template.df我的。file,设置,sample.name =“我的分析”）注意，这个函数需要pandoc还有乳胶这样rmarkdown可以创建PDF报告。
