1.1从先前的稳定的版本更新

PureCN完全向后兼容输入生成的版本1.10、1.12和1.14,但1.16稍微改变偏见数据库和注册的映射区间权重直接到数据库中。简单地重新创建这个RDS文件利用新特性:

Rscript PURECN / NormalDB美元。R——outdir OUT_REF美元\ coveragefiles example_normal。列表\——基因组hg19 normal_panel normal_panel——化验agilent_v6美元

PureCN1.10引入了一个全新的正常的数据库格式等几个重要的改善不是分裂数据库示例性常染色体的正常化。因此有必要重新运行(不仅推荐)NormalDB.R从1.8版本升级的时候。

从1.6版升级,我们强烈推荐本教程后从零开始。

1.2安装

描述的命令行脚本在本教程中,我们将需要安装PureCN与建议的依赖关系:

如果(!requireNamespace (“BiocManager”,悄悄地= TRUE)) install.packages (“BiocManager”) BiocManager::安装(“PureCN”,依赖= TRUE)

另外,手动安装所需要的软件包的命令行脚本:

BiocManager:安装(c (“PureCN”、“optparse”,“TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19。knownGene”、“org.Hs.eg.db”))

(替换hg19你的基因版本)。

使用替代和在许多情况下推荐PSCBS市场细分:

#默认不支持区间权重BiocManager PSCBS::安装(“PSCBS”) #修补PSCBS支持下的区间权重BiocManager::安装(“lima1 / PSCBS”ref =“add_dnacopy_weighting”)

叫突变签名,安装的GitHub版本deconstructSigs包:

BiocManager:安装(“raerose01 / deconstructSigs”)

4.1报道

对于每一个样本,肿瘤和正常,计算GC-normalized保险:

#计算和GC-normalize报道从BAM文件Rscript PURECN美元/覆盖。R——outdir / SAMPLEID \美元——bam $ {SAMPLEID}。bam \ $ OUT_REF / baits_hg19_intervals间隔。txt # GC-normalize覆盖从GATK DepthOfCoverage文件Rscript PURECN美元/覆盖。R——outdir / SAMPLEID \——美元$ {SAMPLEID} .coverage报道。sample_interval_summary \ $ OUT_REF / baits_hg19_intervals.txt间隔

GATK相似,这个脚本也需要一个文本文件包含BAM列表或覆盖文件名称(每行一个)。必须将文件扩展名.list:

#计算和GC-normalize报道从BAM列表中文件Rscript PURECN美元/覆盖。R——outdir \——美元bam法线。列表\ $ OUT_REF / baits_hg19_intervals间隔。txt \——核4

重要的建议:

• 只提供——keepduplicatesorgydF4y2Ba——removemapq0如果你知道你在做什么,总是使用相同的命令行参数对肿瘤和法线

4.2NormalDB

建立一个正常的数据库覆盖正常化,复制路径GC-normalized正常覆盖所有文件在一个文本文件,逐行:

ls - a * loess.txt正常。广州|猫> example_normal。#自已GC-normalized文件列表Rscript PURECN / NormalDB美元。R——outdir OUT_REF美元\ coveragefiles example_normal。列表\——基因组hg19化验agilent_v6 #当正常面板VCF可用无与伦比的样本(强烈推荐)Rscript PURECN / NormalDB美元。R——outdir OUT_REF美元\ coveragefiles example_normal。列表\——基因组hg19 normal_panel normal_panel——化验agilent_v6美元

重要的建议:

• 考虑不同数据库生成差异显著时,例如样品用不同的阅读或插入长度尺寸分布

• 特别是,切忌将获得正常的数据与不同的捕获工具(如。安捷伦SureSelect v4和v6)

• 这里提供一个正常的面板VCF预先执行映射偏见更快的运行时。已是一个唯一的要求广告格式字段包含引用的数量和alt读取所有样本。看到示例文件$ PURECN / normalpanel.vcf.gz。

• 理想的结果,检查interval_weights.png文件找到好的偏离本宽度。您将需要重新运行IntervalFile.R与——offtargetwidth参数和计算保险。

• 的——分析参数是可选的,仅用于提供试验名称添加到输出文件

• 警告指向可能使用错误的鱼饵文件意味着超过5%的目标接近0覆盖在所有正常样本。床上的低覆盖率将生成目标文件——outdir。如果由于任何原因没有访问到正确的文件,建议重新运行IntervalFile.R命令和文件提供这种床——排除。

4.3PureCN

现在assay-specific文件创建和所有保险计算,我们运行PureCN.R规范化、划分和确定纯度和倍性:

mkdir / SAMPLEID #美元没有匹配的正常(最小测试运行)Rscript PURECN / PURECN美元。R——/ SAMPLEID \美元——肿瘤/ SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} _coverage_loess.txt。广州\——sampleid sampleid美元\ vcf {sampleid} _mutect美元。vcf \——normaldb OUT_REF / normalDB_hg19美元。rds \ $ OUT_REF / baits_hg19_intervals间隔。txt \ hg19——基因组# Production pipeline run $ Rscript $PURECN/PureCN.R --out $OUT/$SAMPLEID \ --tumor $OUT/$SAMPLEID/${SAMPLEID}_coverage_loess.txt.gz \ --sampleid $SAMPLEID \ --vcf ${SAMPLEID}_mutect.vcf \ --statsfile ${SAMPLEID}_mutect_stats.txt \ --normaldb $OUT_REF/normalDB_hg19.rds \ --mappingbiasfile $OUT_REF/mapping_bias_hg19.rds \ --intervals $OUT_REF/baits_hg19_intervals.txt \ --snpblacklist hg19_simpleRepeats.bed \ --genome hg19 \ --force --postoptimize --seed 123 # With a matched normal (test run; for production pipelines we recommend the # unmatched workflow described above) $ Rscript $PURECN/PureCN.R --out $OUT/$SAMPLEID \ --tumor $OUT/$SAMPLEID/${SAMPLEID}_coverage_loess.txt.gz \ --normal $OUT/$SAMPLEID/${SAMPLEID_NORMAL}_coverage_loess.txt.gz \ --sampleid $SAMPLEID \ --vcf ${SAMPLEID}_mutect.vcf \ --normaldb $OUT_REF/normalDB_hg19.rds \ --intervals $OUT_REF/baits_hg19_intervals.txt \ --genome hg19 # Recreate output after manual curation of ${SAMPLEID}.csv $ Rscript $PURECN/PureCN.R --rds $OUT/$SAMPLEID/${SAMPLEID}.rds

重要的建议:

• 即使匹配法线是可用的,它通常是最好使用正常的数据库覆盖正常化。当一个匹配提供正常的报道——正常那么正常的池覆盖规范化和去噪步骤跳过!

• 总是提供正常的覆盖数据库忽略低质量区域分割和增加纯合缺失的灵敏度高纯度样品。

• 正常的面板VCF文件是用于映射偏差纠正,特别是推荐没有匹配的法线。看到FAQ的主要装饰图案如何生成这个文件。这不是测试运行的必要条件。

• 的MuTect 1.1.7数据文件(VCF)的主要输出文件除了应提供更好的工件过滤。如果已生成的管道执行构件过滤好,不需要这个文件。

• 的——postoptimize标记定义了纯度应该优化使用这两种等位基因变体分数和拷贝数,而不是拷贝数。这导致一个重要的运行时增加whole-exome数据。

• 如果——从是一个目录,它将使用示例id作为文件所有输出文件的前缀。否则PureCN将使用——从作为前缀。

• 的——平行标志将使当地最适条件的平行安装。看到BiocParallel获取详细信息。这个脚本将使用默认的后端。

• ——funsegmentation PSCBS将成为新的默认在1.18。目前支持区间权重需要一个补丁(见部分1.2)。

• 违约是校准和应该为大多数样本产生接近理想的结果。一些常见的情况下,改变默认值是有意义的:

  • 高纯度、高质量:癌症类型纯度高的预期,如卵巢癌、预计当质量非常好(高覆盖率,年轻的样品),——maxcopynumber 8

  • 小板和高覆盖率:——填充100(或更高版本),需要运行这个填充的变体调用者或没有间隔文件。使用相同的设置面板的法线VCF这样snp侧翼地区有可靠的映射偏差估计。的——maxhomozygousloss参数可能还需要一些调整与大型差距非常小的面板被删除。

  • 细胞系:安全跳过寻找低纯度细胞系的解决方案:——maxcopynumber 8,——minpurity 0.9,——maxpurity 0.99。添加——modelhomozygous发现LOH区域样本中不正常的污染(不提供这个标志匹配正常VCF)中的数据是可用的。

  • cfDNA:——minpurity 0.1,——minaf 0.01(或降低)——错误0.0005(或更低,当有UMI-based纠错)。注意,估计纯度非常错误的真正的纯度低于5 - 7%;这些样品通常标记为non-aberrant。

  • 扩增子数据:——模型betabin(扩增子数据并非官方支持)

  • 所有化验:——maxsegments应该设置一个值,以便无一例外只有质量差的样品超过这个截止。对于癌症类型异质性高,还建议增加——maxnonclonal0.3 - -0.4(这将增加运行时明显whole-exome数据)。

5.1一般使用

如果你已经有了从第三方工具(例如分割CNVkit,GATK4,EXCAVATOR2)。最小测试运行:

Rscript PURECN / PURECN美元。R——出$ / $ SAMPLEID \ SAMPLEID SAMPLEID \美元——segfile / SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} .cnvkit.seg \——vcf {SAMPLEID} _mutect美元。vcf \ $ OUT_REF / baits_hg19_intervals间隔。txt \ hg19——基因组

看到更多的细节和文件格式的主要装饰图案。

5.2推荐CNVkit使用

对于生产管道再次运行我们提供更多的信息分析和基因组。这里一个CNVkit例子:

#推荐:提供一个正常的面板VCF移除映射偏见,pre-compute # position-specific偏见与大板#这更快运行时只需要做一次为每一个分析Rscript PURECN / NormalDB美元。R——outdir OUT_REF——normal_panel normal_panel \美元——化验agilent_v6基因组hg19——力#出口分割cnvkit DNAcopy格式。py出口赛格/ SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} _cnvkit.cns——enumerate-chroms \ - o / SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} _cnvkit。赛格# * .cnr PureCN提供运行和*。赛格文件Rscript PURECN / PURECN美元。R——出$ / $ SAMPLEID \ SAMPLEID SAMPLEID \美元——肿瘤/ SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} _cnvkit.cnr \——segfile / SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} _cnvkit。赛格\——mappingbiasfile OUT_REF / mapping_bias_agilent_v6_hg19美元。rds \——vcf $ {SAMPLEID} _mutect。vcf \——statsfile $ {SAMPLEID} _mutect_stats。txt \——snpblacklist hg19_simpleRepeats。床\——基因组hg19 \ funsegmentation Hclust \——力——postoptimize——123年种子

重要的建议:

• 的——funsegmentation参数控制如果细分的数据应该使用生殖系baf(默认)。将这个值设置为没有一个如果应该使用提供的细分。推荐的Hclust只会集群提供的部分。

• 自CNVkit提供所有必要的信息* .cnr输出文件,——时间间隔参数不是必需的。

• 在测试运行中,尤其是当输入VCF包含匹配的正常信息,——mappingbiasfile可以跳过

• CNVkit运行不正常参考样品不推荐

5.3推荐GATK4使用

#推荐:提供一个正常的面板VCF移除映射偏见,pre-compute # position-specific偏见与大板#这更快运行时只需要做一次为每一个分析Rscript PURECN / NormalDB美元。R——outdir OUT_REF——normal_panel normal_panel \美元——化验agilent_v6——基因组hg19——迫使Rscript PURECN / PURECN美元。R——出$ / $ SAMPLEID \ SAMPLEID SAMPLEID \——肿瘤/美元$ SAMPLEID / $ {SAMPLEID}。hdf5 \——logratiofile / SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} .denoisedCR.tsv \——segfile / SAMPLEID美元/ $ {SAMPLEID} .modelFinal。赛格\——mappingbiasfile OUT_REF / mapping_bias_agilent_v6_hg19美元。rds \——vcf $ {SAMPLEID} _mutect。vcf \——statsfile $ {SAMPLEID} _mutect_stats。txt \——snpblacklist hg19_simpleRepeats。床\——基因组hg19 \ funsegmentation Hclust \——力——postoptimize——123年种子